جنین مرغ. کشت ویروس ها در رشد جنین جوجه

برای مطالعات ویروس شناسی از جنین مرغ 7-12 روزه استفاده می شود. اغلب 9-12 روز، گاهی اوقات 5-12 روز).

قبل از عفونت، زنده ماندن جنین تعیین می شود. در طی اووسکوپی، جنین های زنده متحرک هستند و الگوی عروقی به وضوح قابل مشاهده است. مرزهای کیسه هوا با یک مداد ساده مشخص شده است. جنین مرغ در شرایط آسپتیک و با استفاده از ابزار استریل، پس از درمان پوسته بالای فضای هوا با ید یا الکل آلوده می شود.

روش های آلوده کردن جنین مرغمی تواند متفاوت باشد: کاربرد ویروس در غشای کوریوآلانتوئیک، در حفره آمنیوتیک و آلانتوئیک، در کیسه زرده و بدن جنین. انتخاب روش عفونت به خواص بیولوژیکی ویروس مورد مطالعه بستگی دارد.

دو راه برای آلوده کردن جنین مرغ وجود دارد:

1) باز - پوسته بالای کیسه هوا با الکل و ید درمان می شود، پوسته با استفاده از قیچی تیز بریده می شود، ورق بالای پوسته کیسه هوا برداشته می شود و عفونت انجام می شود. سوراخ با درب یا پوسته شیشه ای مخصوص بسته می شود و با پارافین ذوب شده استریل مهر و موم می شود.

2) بسته - پوسته روی کیسه هوا با الکل و ید درمان می شود، یک سوراخ در پوسته با ابزار سوراخ ایجاد می شود و 0.1-0.2 میلی لیتر از مواد حاوی ویروس با استفاده از یک سرنگ با یک سوزن ضخیم تحت کنترل تزریق می شود. یک اووسکوپ سوراخ با پارافین ذوب شده استریل بسته می شود.

جنین های آلوده به مدت 2-4 روز در ترموستات انکوبه می شوند. سپس آنها را تا 4 درجه سانتیگراد در طول روز برای حداکثر انقباض عروق سرد می کنند. در شرایط استریل باز کنید، پوسته را قبلا با الکل یا ید درمان کرده باشید.

نشانه وجود ویروس در جنین مرغ با مرگ جنین، واکنش هماگلوتیناسیون مثبت روی شیشه با مایع آلانتوئیک یا آمنیوتیک، و با ضایعات کانونی ("پلاک") روی غشای کوریون-آلانتوئیک ایجاد می شود.

ویروس ها را فقط می توان در سلول های زنده پرورش داد. برای این منظور از هر سیستم بیولوژیکی استفاده می شود: موجودات حیوانی، جنین مرغ، کشت سلولی. هنگام انتخاب حیوانات آزمایشگاهی، شرایط زیر باید رعایت شود: - حیوانات باید سالم باشند. تازه واردان به ویواریوم در قرنطینه نگه داشته می شوند (موش ها و موش ها به مدت 14 روز و بقیه به مدت 21 روز). برای حذف عفونت های نهفته (پنهان) با علت ویروسی.

برای همه حیوانات شرایط زیر برآورده می شود: - حیوانات باید به این ویروس حساس باشند. - سن حیوان دارد پراهمیت: نوزادان جوان و تازه متولد شده حساس ترین هستند، اما در برخی موارد از حیوانات بالغ برای شناسایی علائم بالینی واضح بیماری استفاده می شود. - حیوانات باید هم سن و هم وزن بدن باشند. حیوانات خطی برای این کار مناسب ترند، یعنی. در نتیجه همخونی به دست می آید.

برای مطالعات ویروس شناسی از عفونت زیر جلدی، جلدی، داخل جلدی، عضلانی، داخل صفاقی، داخل وریدی، دهانی، داخل بینی و داخل مغزی حیوانات آزمایشگاهی استفاده می شود.

هدف درس:آشنایی دانش آموزان با روش های آلوده سازی جنین مرغ برای کشت ویروس.

تجهیزات و مواد:جنین مرغ 9-12 روز جوجه کشی، اووسکوپ، سواب الکلی، پایه برای جنین، موچین، قیچی، نوار چسب، سوزن، سرنگ، مداد، پانچ، سوزن، جداول، نمودارها، تجهیزات چند رسانه ای، ارائه پاور پوینت MS Officeدر مورد موضوع درس

توضیح معلم.

روش عفونت به طور قابل توجهی بر تولید مثل ویروس ها در جنین تأثیر می گذارد. قبل از عفونت، تخم مرغ های انکوبه شده شمع می شوند و تخم های مرده جدا می شوند. روی پوسته تخم‌های دارای جنین زنده که با رنگ قرمز رگ‌های خونی و حرکت جنین مشخص می‌شوند، محل عفونت با مداد مشخص می‌شود.

جنین ها در یک جعبه استریل با میز کار، دو مدفوع، گاز، منبع آب و وکیوم آلوده می شوند. عفونت در حفره آمنیوتیک در یک اتاق تاریک انجام می شود. محل کارباید به خوبی روشن شود قبل از کار، میز ضد عفونی می شود. برای ضد عفونی کردن سطح تخم مرغ، یک محلول ضد عفونی کننده (الکل 70٪، محلول ید 2٪) و یک چوب چوبی پیچیده شده در پشم پنبه، یک پروب دندان خمیده یا یک مته برای سوراخ کردن پوسته تخم مرغ آماده کنید. تخم ها با استفاده از سرنگ های استریل برای سل و سوزن های مخصوص آلوده می شوند. محل عفونت روی تخم مرغ با پارافین پر شده است. برای انجام این کار، میله های پارافین تهیه می شود: یک میله شیشه ای در لوله آزمایش پر از پارافین مذاب قرار داده می شود و مطمئن شوید که در مرکز لوله آزمایش قرار دارد تا پارافین خنک شود.

هنگامی که به چوب پارافین نیاز است، دیواره های لوله آزمایش روی مشعل گرم می شود و پارافین با استفاده از میله شیشه ای از لوله آزمایش بیرون کشیده می شود. چوب را روی شعله نگه دارید، مقدار پارافین مورد نیاز برای بستن سوراخ تخم مرغ را ذوب کنید. این روش بسیار تمیز است و بخار پارافین تولید نمی کند.

علاوه بر این، یک لیوان با سواب های پنبه ای استریل، یک لیوان با محلول 3 درصد سود سوزآور برای وسایل مورد استفاده و یک ظرف با محلول کلرامین برای اشیاء شیشه ای مستعمل روی میز کار در یک جعبه قرار می گیرد. در صورت لزوم می توانید یک فنجان تخم مرغ، یک فنجان کوچک لعابی و محیط کشت استریل تهیه کنید. میز کار تهیه شده به این صورت به مدت 1-2 ساعت در معرض تابش UV قرار می گیرد.

با توجه به بیماری زایی ویروس های مورد مطالعه، کار با پوشیدن ماسک، دستکش لاستیکی و عینک ایمنی انجام می شود.

شش روش برای آلوده کردن جنین وجود دارد. عفونت در حفره آلانتوئیک و غشای کوریوآلانتوئیک اغلب مورد استفاده قرار می گیرد، کمتر در حفره آمنیوتیک و کیسه زرده، و به ندرت در بدن جنین و رگ های خونی CAO استفاده می شود. انتخاب روش با توجه به گرایش ویروس و همچنین هدف عفونت تعیین می شود. برای هر روش عفونت 0.1-0.2 میلی لیتر ماده عفونی تزریق می شود.

عفونت در حفره آلانتوئیک.

هنگامی که به این روش آلوده می شوند، ویروس های آنفولانزا، بیماری نیوکاسل، رینوپنومونی اسب، استوماتیت تاولی و غیره به خوبی تکثیر می شوند. انواع مختلفی از روش وجود دارد.

گزینه اولجنین به صورت عمودی با انتهای بلانت ثابت می شود. سوراخی به قطر حدود 1 میلی متر در پوسته در سمت جنین ایجاد می شود و گاهی اوقات در سمت مخالف جنین، 5-6 میلی متر بالاتر از مرز محفظه هوا ایجاد می شود. سوزن به موازات محور طولی به عمق 10-12 میلی متر وارد می شود (شکل 16). پس از تزریق مواد حاوی ویروس، سوزن برداشته شده و سوراخ پوسته با یک قطره پارافین استریل ذوب شده بسته می شود.

شکل 16. عفونت در حفره آلانتوئیک (گزینه اول) (به گفته نیکولا)

گزینه دوم.سوراخ ایجاد شده در پوسته بالای محفظه هوا فقط برای خروج بخشی از هوا استفاده می شود. سوراخ خود عفونت در ناحیه بدون عروقی غشای کوریوآلانتوئیک (CAO) در کنار جنین ایجاد می شود. سوزن به عمق بیش از 2-3 میلی متر وارد می شود. مایع عفونی را در حجم 0.1-0.2 میلی لیتر تزریق کنید و سوراخ را با پارافین ببندید (شکل 17 را ببینید).

عفونت غشای کوریوآلانتوئیک.

این روش برای آلوده کردن جنین مرغ اغلب برای کشت ویروس های اپیتلیوتروپ و پانتروپیک آبله، لارنگوتراکئیت عفونی پرندگان، دیستمپر، بیماری اوژسکی، زبان آبی و غیره استفاده می شود.

چنین عفونتی می تواند از طریق یک محفظه هوای طبیعی یا مصنوعی انجام شود.

برای عفونت از طریق یک محفظه هوای طبیعیجنین به صورت عمودی روی یک سه پایه با انتهای صاف قرار می گیرد و یک پنجره گرد با قطر 15-20 میلی متر در پوسته در مقابل مرکز محفظه هوا بریده می شود. از طریق این پنجره، غشای زیر پوسته با موچین برداشته می شود. 0.2 میلی متر از یک تعلیق حاوی ویروس در ناحیه در معرض CAO اعمال می شود (شکل 18)، سوراخ با یک گچ چسب یا در موارد کمتر با یک شیشه پوششی که با پارافین مذاب تقویت شده است بسته می شود.

عفونت از طریق یک محفظه هوای مصنوعیبیشتر از اول استفاده می شود، زیرا از تماس مواد حاوی ویروس با سطح بزرگتر CW اطمینان حاصل می کند و بنابراین منجر به تشکیل مقدار بیشتری از ویروس می شود.

شکل 17. عفونت یک جنین مرغ در حفره آلانتوئیک (گزینه دوم) (طبق گفته نیکولا)

شکل 18. عفونت در KhAO از طریق یک محفظه هوای طبیعی (طبق گفته نیکولاو و همکاران)

شکل 19. عفونت یک جنین مرغ در KhAO از طریق یک محفظه هوای مصنوعی (طبق گفته نیکولائو و همکاران)

برای آلوده کردن جنین با استفاده از این روش، آن را به صورت افقی در یک پایه قرار می دهند که جنین رو به بالا باشد. دو سوراخ در پوسته ایجاد می شود: یکی کوچک در بالای مرکز محفظه هوا (طراحی شده برای مکش هوا از آن)، و دیگری با قطر 0.2-0.5 سانتی متر در طرف، در سمت جنین. پیچیدگی روش به این صورت است که هنگام ایجاد سوراخ دوم ابتدا باید تکه ای از پوسته را با احتیاط جدا کنید، سپس با حرکت کشویی بدون آسیب رساندن به ماده شیمیایی، پوسته را به طرفین ببرید تا هوا از داخل آن عبور کند. کاستی. پس از این، هوا با استفاده از یک حباب لاستیکی از طریق سوراخ اول به بیرون از محفظه هوای طبیعی مکیده می شود (شکل 19، a). که XAO است (شکل 19، ب).

از طریق سوراخ کناری، یک مایع عفونی به سطح CAO اعمال می شود و سوراخ با یک تکه نوار چسب بسته می شود. نیازی به بستن سوراخ اول نیست، زیرا لایه داخلی غشای پوسته در اثر این روش عفونت آسیب نمی بیند و همچنان به عنوان مانعی برای میکرو فلور محیطی عمل می کند.

انکوباسیون بیشتر جنین های آلوده به این روش در یک موقعیت افقی با دهانه جانبی رو به بالا انجام می شود.

عفونت در کیسه زرده.

بیشتر برای تکثیر کلامیدیا و همچنین ویروس های بیماری مارک، رینوپنومونی اسب، زبان آبی گوسفند و غیره استفاده می شود. جنین های 5-7 روزه و گاهی 2-3 روزه را آلوده می کنند (RIF). ویروس تب دره). دو گزینه عفونت استفاده می شود.

گزینه اولجنین ها در یک سه پایه در حالت عمودی قرار می گیرند. سوراخی در پوسته بالای مرکز محفظه هوا ایجاد می شود و یک سوزن به عمق 3.5-4 سانتی متر با زاویه 45 درجه نسبت به محور عمودی در جهت مخالف با محل جنین وارد می شود. 20).

شکل 20. عفونت یک جنین جوجه به کیسه زرده (طبق گفته نیکولائو و همکاران)

گزینه دوم.گاهی اوقات یک مسیر مشابه از عفونت روی جنینی که به صورت افقی در سه پایه نصب شده انجام می شود. در این حالت جنین در پایین و زرده بالای آن قرار دارد. سوراخ پوسته با یک قطره پارافین مذاب بسته می شود.

عفونت در حفره آمنیوتیک.

برای این منظور از جنین های 6 تا 10 روزه استفاده می شود. این روش برای کشت ویروس های آنفولانزا، نیوکاسل، رینوپنومونی اسب و غیره استفاده می شود. دو روش عفونت وجود دارد.

روش بستهعفونت در یک جعبه تاریک انجام می شود. تخمک در حالت افقی روی اووسکوپ قرار می گیرد و جنین رو به بالا است. یک سوزن با انتهای صاف از طریق سوراخی در پوسته بالای محفظه هوا به سمت جنین وارد می شود. اثبات نفوذ سوزن به آمنیون حرکت بدن جنین در جهت حرکت است.

روش بازپوسته بالای محفظه هوا برش داده می شود تا پنجره ای به قطر 1.5-2.5 سانتی متر تشکیل شود و از طریق آن غشای زیر پوسته با موچین تحت کنترل چشم برداشته می شود. سپس موچین های آناتومیک (14 سانتی متر) با فک های بسته هدایت می شوند و غشای کوریوآلانتوئیک را به سمت جنین هل می دهند. وقتی موچین به آن رسید، فک ها باز می شوند، غشای آمنیوتیک را به همراه CAO گرفته و آن را به سمت پنجره بکشید. با نگه داشتن موچین با غشای آمنیون ثابت در آن با دست چپ، یک ماده حاوی ویروس معرفی می شود (شکل 21). سپس تمام غشاها پایین می آیند، پنجره با گچ چسب بسته می شود و جنین در حالت عمودی انکوبه می شود.

شکل 21. عفونت جنین جوجه در آمنیون روش باز(طبق گفته نیکولائو و همکاران)

عفونت در رگ های خونی XAO.

هنگام تخمک گذاری رویان های 11-13 روزه، یک رگ خونی بزرگ مشاهده می شود. همانطور که پیشرفت می کند، بخشی از پوسته برداشته می شود، 1-2 قطره الکل ریخته می شود، که غشای پوسته را برای مدتی شفاف می کند. تحت کنترل چشم با استفاده از اووسکوپ، سوزن وارد رگ می شود که تحرک آن با حرکات جانبی کوچک سوزن تایید می شود. ناحیه در معرض غشاء زیر پوسته با یک تکه گچ چسب پوشانده شده است.

این ماده همچنین می تواند به روشی کمی متفاوت وارد رگ ها شود: پوسته بالای محفظه هوا بریده می شود، غشای زیر پوسته با الکل مرطوب می شود و مواد وارد رگ های XAO می شوند که قابل مشاهده هستند. سوراخ با یک تکه نوار چسب استریل پوشانده شده است.

روش های فنی شرح داده شده برای عفونت تجربی جنین مرغ تنها مواردی نیستند، بلکه گزینه های مختلفی دارند.

عفونت در بدن جنین.

جنین 7-12 روزه برای عفونت استفاده می شود. دو نسخه شناخته شده از روش وجود دارد.

گزینه اولآمنیون را مانند آمنیون به صورت بسته آلوده می کنند با این تفاوت که یک سوزن تیز می گیرند و روی اووسکوپ نشانگر ورود سوزن به بدن تابع جنین در نظر گرفته می شود. به حرکات سوزن

گزینه دوم.آنها آمنیون را مانند روش باز آلوده می کنند: از طریق پنجره ای در پوسته، بدن جنین با موچین به سمت بالا کشیده می شود. این ماده به مغز یا نواحی خاصی از بدن تزریق می شود. با چنین روش های عفونت، درصد قابل توجهی از مرگ غیر اختصاصی جنین وجود دارد.

تجمع ویروس در جنین جوجه

قبل از جوجه کشی بیشتر، روی پوسته جنین مرغ آلوده به هر روشی، با یک مداد ساده (گرافیتی) می نویسند که جنین با چه چیزی و در چه زمانی آلوده شده است و در صورت لزوم اطلاعات دیگری را نیز می نویسند. جنین های مرغ آلوده برای جوجه کشی بیشتر در یک ترموستات قرار می گیرند و طی آن ویروس های معرفی شده تکثیر شده و در ساختارهای مربوطه جمع می شوند. دمای انکوباسیون جنین ها از 33 تا 38 درجه سانتی گراد بسته به ویژگی های ویروسی که عفونت با آن انجام شده است متفاوت است. جنین ها به طور مداوم تحت نظارت قرار می گیرند، روی اووسکوپ بررسی می شوند و جنین های مرده انتخاب می شوند.

مرگ جنین ها در 24 ساعت اول پس از عفونت اغلب به دلیل تکثیر قارچ ها، میکرو فلور باکتریایی وارد شده به جنین همراه با تلقیح یا آسیب در حین عفونت است. این مرگ غیر اختصاصی در نظر گرفته می شود. در تاریخ های بعدی، جنین ها به عنوان یک قاعده، در نتیجه تکثیر ویروس در جنین می میرند. پس از کشف جنین های مرده، آنها بلافاصله به یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد منتقل می شوند. چنین شرایطی از یک طرف به حفظ فعالیت ویروس انباشته شده در جنین کمک می کند و از طرف دیگر به متراکم شدن بافت ها و خالی شدن رگ های خونی کمک می کند که تشریح بعدی را تا حد زیادی تسهیل می کند.

جنین ها تا زمانی که حداکثر تجمع ویروس رخ دهد، انکوبه می شوند. برای هر ویروس و حتی سویه، این دوره خاص است و از 2 تا 7-8 روز متغیر است. بنابراین، برای سویه H ویروس بیماری نیوکاسل 2-3 روز، برای سویه B همان ویروس 5 روز، برای ویروس لارنگوتراکئیت عفونی پرندگان - 5 روز و غیره است. سپس تمام جنین ها با خنک کردن در دمای 4 درجه سانتیگراد برای مدت زمان کشته می شوند. حداقل 3-4 ساعت و باز است.

تخم مرغ جدا شده

این روش بر اساس برداشتن جنین از تخم در دوره ای است که غشای کوریوآلانتوئیک از داخل کاملاً با پوسته آن مجاور است. اگر یک محیط مغذی داخل چنین تخم مرغی اضافه شود، نوعی کشت بافتی تشکیل می شود که در آن ویروس می تواند تکثیر شود. این روش چندین مزیت دارد: به شخص اجازه می دهد تا ویروس خالص تری نسبت به مایع آلانتوئیک آمنیوتیک بدست آورد که برای کاهش خواص آلرژی زایی واکسن های تهیه شده از این ماده مهم است. عدم وجود کیسه زرده و در نتیجه آنتی بادی های خاص موجود در آن باعث می شود که برخی از ویروس ها بهتر تکثیر شوند. در برخی موارد، این روش نتایج خوبی را در کار تشخیصی به دست می‌دهد، زیرا می‌تواند مقادیر زیادی از مواد آزمایش را معرفی کند، که امکان جداسازی ویروس را افزایش می‌دهد.

این روش در سال 1949 توسط Bernkopf پیشنهاد شد، اما به دلیل مشکلات در کاربرد آن به طور گسترده مورد استفاده قرار نمی گیرد. این مشکلات با خاصیت غشای کوریوآلانتوئیک برای جدا شدن از پوسته در طول انکوباسیون همراه است که ارزش کشت را کاهش می دهد و دستکاری در دستیابی به ویروس و جایگزینی محیط غذایی را پیچیده می کند.

E. Groiel (1963) تعدادی اصلاحات را معرفی کرد که این مشکلات را از بین برد. او استفاده از تخم‌های 15 روزه یا حتی مسن‌تر را پیشنهاد کرد که باید در طول جوجه‌کشی مرتباً چرخانده شوند تا از رشد یکنواخت پوسته روی پوسته تخم مرغ اطمینان حاصل شود. هنگام روشن شدن، مرزهای محفظه هوا مشخص می شود. پوسته 0.5 سانتی متر بالاتر از این خط اره می شود، پارافین مذاب (56-58 درجه سانتیگراد) روی لبه پوسته ریخته می شود که سفت شده و لبه تخم مرغ ثابت می شود. سپس یک سوراخ گرد در غشای بالای جنین بریده می شود و یک لبه باریک در اطراف آن باقی می ماند. مرحله بعدی این است که جنین را با دقت از تخم خارج کنید. در این حالت تخم مرغ را باید در حالت افقی نگه داشت و به آرامی چرخاند. به این ترتیب رگ های متصل کننده جنین با CAO پیدا شده و با قیچی بریده می شوند. اگر تخم به صورت عمودی نگه داشته شود، جنین با جرم خود پوسته را به عقب می کشد و معمولاً آن را در ناحیه انتهای تیز تخمک می کند. ورود حتی مقدار کمی مایع بین مواد شیمیایی و پوسته باعث جدا شدن کامل پوسته در عرض 1-2 روز می شود.

پس از برداشتن جنین، غشای پوششی تخم مرغ چندین بار با محلول نمکی خنک شده تا دمای 0-4 درجه سانتیگراد شسته می شود تا مایع شفاف شود. سپس 20 میلی لیتر از یک محیط مغذی که تا 37 درجه سانتیگراد گرم شده است وارد حفره تخم مرغ می شود و تخم مرغ را با یک کلاه لاستیکی استریل می بندند و قبلاً آن را در پارافین غوطه ور کرده اند. لوله ای با درپوش لاستیکی تعبیه شده در تخم مرغ امکان جمع آوری و تجویز مایع را بدون خطر آلودگی باکتریایی فراهم می کند. چنین شی بیولوژیکی برای چندین روز زنده می ماند.

طبق روش یوشینو و دیگران، حفره تخم‌های جداشده با محلول آگار در محلول هنکس پر می‌شود. تخم های جدا شده از طریق لوله ای در کلاهک آلوده می شوند.

سوالات کنترلی:

1. ساختار جنین مرغ.

2. چرا از جنین مرغ در ویروس شناسی استفاده می شود؟

3. ساختار جنین مرغ در حال رشد چگونه است؟

جنین مرغ-- یک سیستم بسیار ارزان و راحت برای کشت ویروس های آنفولانزا. تقریباً همه سویه‌های ویروس‌ها با منشأ انسانی و حیوانی در جنین‌ها به یک درجه یا درجه دیگر تکثیر می‌شوند. سویه‌های آزمایشگاهی که به بهترین وجه با این سیستم سازگار هستند، تیترهای نسبتاً بالایی در جنین تولید می‌کنند، یا 10-10 PFU در هر جنین). علاوه بر این، جنین از محیط خارجی جدا می شود و بنابراین ویروس نیازی به تکثیر در آن ندارد. ايجاد كردنشرایط استریل خاص

ویروس معمولاً به داخل حفره آلانتوئیک پر از مایع تخمک تزریق می شود، از آنجا که می تواند به غشای کوریوآلانتوئیک نفوذ کند و سلول های تشکیل دهنده آن را آلوده کند. نتاج ویروسی در مایع آلانتوئیک رها می شود و با ساکشن این مایع به راحتی از تخم خارج می شود. برخی از سویه ها Vبه ویژه جدایه های طبیعی جدید و همچنین ویروس هایی مانند باروی غشای کوریو-کالانتوئیک به خوبی تکثیر نمی شود، اما وقتی مستقیماً در حفره آمنیوتیک تزریق می شود، تکثیر می شود. در این حالت، ویروس به بافت های مختلف جنین دسترسی پیدا می کند و فرزندان حاصل در مایع آمنیوتیک آزاد می شوند که می توانند به طور جداگانه استخراج شوند.

این ویروس در جنین های 10 تا 12 روزه بهترین تکثیر را دارد. تخم های بارور شده تازه باید خریداری و برای مدت زمان مورد نیاز در آزمایشگاه انکوبه شوند. برای انجام این کار، نیازی به داشتن تجهیزات خاصی ندارید، اما دستگاه جوجه کشی بسیار راحت است. با این حال، اگر تخم‌ها مرتباً چرخانده شوند، می‌توان آنها را با موفقیت در یک ترموستات معمولی در یک جو مرطوب در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه کرد. درجه تخم مرغ اهمیت خاصی ندارد، اما در برخی موارد مهم است که احتمال عفونت تخم مرغ با سایر میکروارگانیسم ها را حذف کنیم. برخی از تامین کنندگان تخم مرغ های ویژه و بدون آلودگی را می فروشند.

قبل از عفونت، باید مطمئن شوید که تخمک ها واقعا بارور شده اند. برای انجام این کار، فقط به تخم مرغ نزدیک یک منبع نور روشن در یک اتاق تاریک نگاه کنید. 4-5 روز پس از لقاح، جنین باید به وضوح قابل مشاهده باشد.

در پاساژ استاندارد سویه های آزمایشگاهی، تلقیح ویروسی معمولاً نمونه ای از آلانتوئیک یا مایع کشت آلوده است. به عنوان یک قاعده، نمونه ها قبل از استفاده با محلول نمک هنکس تا غلظت ویروس 10-10 PFU/ml رقیق می شوند، زیرا وارد کردن مقدار زیادی ویروس به تخم مرغ باعث تشکیل DIV می شود. اگر ویروس رقیق شده باید قبل از عفونت ذخیره شود، ژلاتین باید به محلول رقیق اضافه شود. به طور طبیعی، لازم است از عقیم بودن ویروس مورد استفاده برای عفونت اطمینان حاصل شود. در مواردی که این کار دشوار است، آنتی بیوتیک جنتامایسین به تلقیح اضافه می شود.

این روش ها شامل استفاده از همگن سازی برای آسیاب نمونه ها، سانتریفیوژ با سرعت پایین برای شفاف سازی آنها و تزریق مایع رویی رقیق نشده به حفره آمنیوتیک است.

عفونت جنین.

I. ورود ویروس به حفره آلانتوئیک

• 1. تخم مرغ ها را در کنار آنها قرار دهید و روی آن را با الکل پاک کنید عقیم سازیناحیه اطراف نقطه عفونت
• 2. با استفاده از مته دندانپزشکی مجهز به دیسک برش، سوراخ کوچکی در پوسته ایجاد می شود. سوراخ باید به قدری عمیق باشد که بتوان سوزن را وارد کرد. برایتزریق می شود، اما توصیه می شود به غشای داخلی پوسته آسیب نرسانید.
• 3. با استفاده از یک سرنگ با سوزن شماره 25، 0.1 میلی لیتر ویروس به حفره آلانتوئیک تلقیح می شود و سوزن را مستقیماً زیر پوسته قرار می دهد.
• 4. سوراخ در پوسته با مقدار کمی موم ذوب شده مهر و موم شده است.
• 5. تخم های آلوده در یک ترموستات در جو مرطوب با انتهای نوک تیز به سمت پایین انکوبه می شوند. در زمان جوجه کشی نیازی به چرخاندن تخم ها نیست.

II. تزریق ویروس به حفره آمنیوتیک

• 1. انتهای صاف تخم مرغ با پاک کردن با الکل استریل می شود و سوراخ کوچکی مانند نمودار ایجاد می شود.
• 2. تخمک در نزدیکی یک منبع نور روشن در یک اتاق تاریک قرار می گیرد تا جنین قابل مشاهده باشد.
• 3. سوزن شماره 23 به طول 4 سانتی متر داخل سوراخ ایجاد شده و سپس با حرکتی تیز در جهت جنین - داخل حفره آمنیوتیک قرار می گیرد. در این حالت 0.1 میلی لیتر ویروس اضافه می شود و سوزن با دقت خارج می شود.
• 4. سوراخ در پوسته با موم ذوب شده مهر و موم شده و تخم مرغ ها مانند بالا انکوبه می شوند.

زمان جوجه کشی

زمان انکوباسیون بهینه مورد نیاز برای به دست آوردن حداکثر بازده ویروس بستگی به سویه خاص دارد و باید به صورت تجربی تعیین شود. برای برخی از سویه های ویروس آنفولانزای A، به عنوان مثال ویروس دیستمپر مرغی، حداکثر عملکرد پس از 24-26 ساعت به دست می آید، در حالی که بیشتر سویه های ویروس آنفولانزای انسانی A، و همچنین ویروس های نوع B و بابه 48-72 ساعت انکوباسیون نیاز دارد.

مجموعه ویروس.

قبل از تلاش برای حذف مایع حاوی ویروس از تخم مرغ، توصیه می شود تخم مرغ را به مدت 4 تا 18 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد یا به مدت 30 دقیقه در دمای 20- درجه سانتی گراد خنک کنید. هنگامی که سرد می شود، جنین می میرد و رگ های خونی اطراف باریک می شوند. بنابراین، احتمال آلودگی مایع حاوی ویروس به گلبول های قرمز که می تواند بخشی از ویروس را ببندد و در نتیجه عملکرد آن را کاهش دهد، به میزان قابل توجهی کاهش می یابد. اگر نتوان از آلودگی با گلبول های قرمز جلوگیری کرد، می توان با انکوبه کردن مواد به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد، از دست دادن ویروس را به حداقل رساند. تحت این شرایط، نورآمینیداز ویریون گیرنده های گلبول قرمز را که ویروس به آنها متصل می شود، از بین می برد و آزاد می شود.

I. جمع آوری مایع آلانتوئیک

• 1. تخم‌مرغ‌ها را روی پایه قرار داده و سطح آن‌ها را با الکل استریل کنید.
• 2. انتهای صاف تخم مرغ با استفاده از موچین استریل یا دستگاه مخصوص باز می شود. پوسته اطراف کیسه هوا برداشته می شود و امکان دسترسی به حفره آلانتوئیک را فراهم می کند.
• 3. با استفاده از موچین استریل با نوک بلانت، غشای کوریوآلانتوئیک را پاره کرده و آن را به لبه تخم مرغ منتقل کنید.
• 4. جنین و کیسه زرده به دقت با موچین دور می شوند و مایع آلانتوئیک با یک پیپت با انتهای پهن مکیده می شود. از یک تخم مرغ متوسط، 7-10 میلی لیتر مایع زرد کم رنگ به دست می آید. مخلوط زرده در مایع آلانتوئیک در تصفیه بیشتر ویروس اختلال ایجاد می کند، بنابراین، زمانی که انتخاباز آسیب به کیسه زرده باید اجتناب شود. اگر ویروس برای مطالعات بیوشیمیایی در نظر گرفته شده است، به عنوان مثال، برای تجزیه و تحلیل فعالیت آنزیم های ویریون، مایع آلانتوئیک باید در دمای 0 درجه سانتیگراد جمع آوری شود.
• 5. مایع آلانتوئیک با سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه در 10000 شفاف می شود. g و مایع رویی را در دمای 4 یا 70- درجه سانتیگراد نگهداری کنید.

II. جمع آوری مایع آمنیوتیک

• 1. سطح تخم مرغ استریل می شود و انتهای بلانت به شرح بالا باز می شود. تا جایی که ممکن است پوسته آن را بردارید تا محتویات تخم مرغ به راحتی جدا شود.
• 2. غشای کوریوآلانتوئیک پاره شده و محتویات تخم مرغ در ظرف پتری استریل ریخته می شود. در این حالت، حفره آمنیوتیک باید دست نخورده باقی بماند.
• 3. بابا استفاده از سرنگ با سوزن شماره 25، محتویات تا حد امکان از حفره آمنیوتیک خارج می شود.
• 4. مایع آمنیوتیک مانند مایع آلانتوئیک شفاف و ذخیره می شود.

خروجی مورد انتظار

شدت تولید مثل ویروس در جنین به سویه خاص بستگی دارد. سویه های وحشی در ابتدا عیار بسیار پایینی می دهند، اما پس از چندین بار عبور در جنین، تیتر به طور قابل توجهی افزایش می یابد. برای سویه های آزمایشگاهی مختلف که برای تولیدمثل روی جنین ها سازگار شده اند، بازده نیز به طور قابل توجهی متفاوت است، اما در بیشتر موارد 2000-5000 و گاهی تا 20000 HAE/ml ویروس در مایع آلانتوئیک تجمع می یابد. بدیهی است که سازگاری با تولید مثل در جنین ها مرتبط است باانتخاب گونه های ژنتیکی، بنابراین شما باید داشته باشید Vبه خاطر داشته باشید که نتایج مطالعات ژنتیکی و بیوشیمیایی دقیق سویه های عبور داده شده روی جنین لزوماً جدایه اصلی را مشخص نمی کند.

جنین مرغ جنین مرغ

(CE) - جنین مرغ واقع در مراحل مختلف رشد جنینی. در میکروبیول در عمل از آنها برای جداسازی، کشت و شناسایی ویروس ها، ریکتزیا و گاهی اوقات باکتری ها استفاده می شود. برای اهداف آزمایشگاهی، EC های تازه و بارور شده با پوسته ای شفاف و بدون ترک انتخاب می شوند. جوجه کشی در لانه های سه پایه با انتهای صاف تخم به سمت بالا در دستگاه های جوجه کشی با تهویه خوب یا ترموستات ها در دمای 37-37.5 درجه سانتی گراد، رطوبت نسبی 63-65٪ انجام می شود. برای عفونت، جنین های 4-13 روزه با رگ های خونی مشخص، کیسه زرده و سایه متحرک انتخاب می شوند. قبل از عفونت، پوسته تخم مرغ با الکل درمان می شود، سوزانده می شود و در ناحیه تزریق (معمولا بالای محفظه هوا) با تنتور ید 2٪ آغشته می شود. مواد یا تحقیق با باز کردن یا بدون باز کردن پوسته، به کیسه زرده (ریکتسیا)، داخل حفره‌های آلانتوئیک یا آمنیوتیک (اکثر ویروس‌ها) تزریق می‌شود و روی غشای کوریون-آلانتوئیک اعمال می‌شود. کمتر متداول است که به بدن جنین یا داخل وریدی تزریق می شود. EC های آلوده تحت شرایط و برای دوره هایی که به نوع میکروب و اهداف مطالعه بستگی دارد در یک ترموستات قرار می گیرند. برخی از داده ها در مورد نتایج عفونت را می توان با بررسی خارجی EC در زیر میکروسکوپ (تزریق رگ های خونی، از دست دادن تحرک و غیره) به دست آورد. با این حال، در بیشتر موارد، EC باز می شود. برای انجام این کار، پس از درمان با الکل و تنتور ید، پوسته بالای مرز کیسه هوا بریده می شود، ابتدا آلانتوئیک و سپس مایع آمنیوتیک با پیپت یا سرنگ پاستور مکیده می شود و از آسیب به عروق و رگ ها جلوگیری می شود. کیسه زرده جنین و غشای کوریوآلانتوئیک از پوسته خارج شده، در ظروف استریل قرار می گیرند و با تقطیر استریل شسته می شوند. آب و بازرسی کنید دوره بعدی مطالعه جنین و مایعات آن به نوع میکروب یا ویروس و هدف آزمایش بستگی دارد.

(منبع: فرهنگ اصطلاحات میکروبیولوژی)

ببینید "جنین مرغ" در فرهنگ های دیگر چیست:

جنین سمی- سمیت جنینی، توانایی عوامل فیزیکی، بیولوژیکی، شیمیایی و سایر عوامل برای تأثیر منفی بر روی جنین در حال رشد. اثر جنینی مواد مختلف با قرار گرفتن در معرض ماده ها مشخص می شود... ... فرهنگ لغت دایره المعارف دامپزشکی

درخواست "جوجه ها" به اینجا هدایت می شود. معانی دیگر را نیز ببینید. ? مرغ خانگی ... ویکی پدیا

جوجه ها جوجه ها تزئینی برای هر حیاط هستند طبقه بندی علمی پادشاهی: حیوانات نوع: کلاس Chordata ... ویکی پدیا

معرفی روش های کشت ویروس در جنین مرغ در توسعه ویروس شناسی اهمیت زیادی داشت. برای تکثیر ویروس از جنین مرغ 7-12 روزه استفاده می شود که در ترموستات 37 درجه سانتیگراد انکوبه می شود. شرط لازم برای رشد مناسب جنین حفظ رطوبت هوای معینی است که می توان با قرار دادن آن ایجاد کرد. ظرفی با آب در ترموستات کشت ویروس در جنین مرغ در نقاط مختلف جنین آلوده انجام می شود:

1) روی غشای کوریون-آلانتوئیک؛

2) به حفره آلانتوئیک.

3) به حفره آمنیوتیک؛

4) داخل کیسه زرده.

عفونت جنین مرغ در جعبه با استفاده از ابزار استریل انجام می شود. قبل از: عفونت، جنین مرغ دو بار با یک سواب پنبه ای مرطوب شده با الکل پاک می شود.

عفونت غشای کوریون-آلانتوئیک. پس از ضد عفونی کردن تخم مرغ، تکه ای از پوسته را با دقت از انتهای صاف جدا کنید، غشای زیر پوسته را بردارید - این غشای کوریون-آلاتیوئیک را نشان می دهد. مواد عفونی به مقدار 0.1-0.2 میلی لیتر با استفاده از سرنگ یا پیپت پاستور روی غشای کوریون-آلانتوئیک اعمال می شود. پس از عفونت، سوراخ با کلاهک بسته می شود و فاصله بین آن و جنین مرغ با پارافین پر می شود. در سمت دیگر تخم مرغ، نام ماده عفونی و تاریخ آلودگی را با یک مداد ساده بنویسید.

عفونت در حفره آمنیوتیک.تخمک اووسکوپیک است و ناحیه ای در سمت جانبی انتخاب می شود که کوریون-آلانتوئیس فاقد رگ های خونی بزرگ است. این قسمت با مداد مشخص شده است. تخم ها روی پایه در حالت افقی قرار می گیرند، ضد عفونی می شوند و با نیزه استریل مخصوص سوراخ سوراخ می شود. وپوسته به عمق 2-3 میلی متر، که از طریق آن یک سوزن با مواد عفونی در همان فاصله به طور مستقیم به حفره آمنیوتیک وارد می شود. برای جلوگیری از برگشت مایع تزریق شده، ابتدا سوراخی در بالای کیسه هوا ایجاد می شود. پس از آن هر دو سوراخ با پارافین پر می شوند.

عفونت در حفره آلانتوئیک.عفونت نیز در یک جعبه سایه دار انجام می شود. فضای هوا مشخص شده است، پوسته بالای فضای هوا ضد عفونی شده و یک سوزن سرنگ با مواد از طریق سوراخی در پوسته به سمت جنین وارد می شود. اگر سوزن وارد حفره آلانتوئیک شود، جابجایی سایه جنین مشاهده می شود. پس از عفونت، سوراخ با پارافین پر می شود.

عفونت در کیسه زرده.پوسته ضد عفونی شده است. تخم مرغ روی پایه قرار می گیرد و انتهای آن صاف به سمت راست است به طوری که علامت زرده رو به بالا باشد. یک سوراخ در مرکز بالای محفظه هوا سوراخ شده است. یک سوزن سرنگ از طریق سوراخی در پوسته در جهت افقی به عمق 2-3 میلی متر وارد می شود که وارد کیسه زرده می شود. این ماده در حجم 0.2-0.3 میلی لیتر تجویز می شود. پس از معرفی مواد، سوراخ واکس زده می شود.

دما و مدت انکوباسیون به خواص بیولوژیکی ویروس بستگی دارد. تخمک های آلوده روزانه چک می شوند و برای بررسی زنده ماندن جنین اووسکوپ می شوند. اگر جنین در روز اول بمیرد، معمولاً علت آن ضربه در حین عفونت است. چنین تخم هایی از روی تجربه بیرون می آیند. وجود ویروس در جنین آلوده با تغییرات مشخصه در غشای کوریون-آلانتوئیک جنین مرغ آلوده تعیین می شود. ویروس هایی که فعالیت هماگپوتین کنندگی ندارند با استفاده از RSC شناسایی می شوند. برای تشخیص ویروس در مایع آلانتوئیک یا آمنیوتیک جنین های آلوده، RGA انجام می شود.